Методы фармацевтического анализа

Расстройства здоровья

Микроскопическое исследование эякулята

Микроскопическое исследование эякулята является самым важным звеном спермограммы. При микроскопии оценивается:

· концентрация сперматозоидов,

· их подвижность и

· строение;

· проводится подсчет и изучение иных клеточных элементов эякулята.

Количество и подвижность сперматозоидов изучается на прижизненных нативных препаратах без окраски. Для оценки жизнеспособности используются нативные препараты с прижизненной окраской. Морфология изучается после фиксации препарата и специального окрашивания. Исследование выполняется с помощью светового или фазово-контрастного микроскопа с рабочим увеличением (объектив 40х, окуляр10х). Конденсор опущен.

Эякулят сразу же помещается в термостат при +370C. Микроскопия выполняется после полного разжижения, не позже чем через 60 минут. Концентрация сперматозоидов и их подвижность определяется при помощи счетной камеры Горяева. Счетная камера изготавливается из плотного предметного стекла. На ее поверхности имеется 225 квадратов (15 рядов по 15 квадратов). Эти квадраты называются «большими». Кроме того, на поверхности камеры имеется «малые квадраты», которые имеют размеры 0,05 мм. Между стенкой камеры (там, где нанесена сетка) и боковыми частями имеется зазор в 0,1 мм. После нанесения материала камера прикрывается и притирается покровным стеклом, что фиксирует определенный объем исследуемого материала. Камера Горяева и покровные стекла должны быть вымыты и обезжирены смесью Никифорова, подогреты до +250C. Кроме того, рекомендуется наносить часть материала и на обычные предметные стекла, обработанные таким же образом. Дело в том, что опытный врач-лаборант при осмотре нативного препарата спермы на обычном предметном стекле может с большой долей достоверности определить основные показатели спермограммы.

После полного разжижения эякулят разводят физиологическим раствором также комнатной температуры в соотношении 5:1. Иногда разведение увеличивают, особенно если имеется молочно-белый цвет эякулята. Полученный материал несколько раз осторожно набирают и опорожняют в пипетку. Далее каплю эякулята подводят под покровное стекло. Материал должен равномерно распределиться по всей камере. После чего необходима стабилизация препарата. Для этого в течение 1 – 2 минут его оставляют на предметном столе микроскопа. Рекомендуется использовать предметный столик микроскопа с подогревом до +370C. В случае, если этого нет, возможно переместить приготовленную и заправленную эякулятом камеру в термостат на 15 минут при той же температуре. После этого переходят непосредственно к микроскопии.

Исследование не вызывает сложностей, если в большом квадрате камеры Горяева расположено не менее 30 – 40 сперматозоидов. Если это число более 150 – 200, то рекомендуется увеличить разведение в 2, а иногда и в 3 раза.

Если же наоборот клеточных элементов слишком мало, то тогда выполняется центрифугирование эякулята. Излишки жидкости удаляют пипеткой. Следует заметить, что возможно некоторое изменение морфологии в худшую сторону при проведении центрифугирования.

Для оценки достоверности полученного результата исследуют второй препарат. Подсчет ведется, исследуя около 200 – 300 клеток. При подсчете 50 клеток результат считается статистически недостоверным, если разница между двумя исследованиями составляет менее 5 клеток. При подсчете 100 клеток это значение равно 7. И при подсчете 250 клеток – 9.

Во время проведения микроскопического спермиологического обследования определяются следующие параметры:

1. Определение количества сперматозоидов.

2. Оценка подвижности сперматозоидов.

3. Оценка жизнеспособности сперматозоидов.

4. Оценка морфологии сперматозоидов.

5. Исследование «круглых» клеток.

6. Определение агглютинации сперматозоидов.

7. Оценка неклеточных структур.

Определение количества сперматозоидов

Определение количества сперматозоидов выполняется при микроскопии препарата в счетной камере. Для того, чтобы движения сперматозоидов не вызывали технических сложностей, необходимо провести их обездвиживание. Для этого используется раствор, который содержит 50 грамм бикарбоната соды (NaHCO3), 10 мл 35% раствора формалина, разведенного в 1 литре воды. Это рекомендация ВОЗ. Обездвиживание происходит в камере Горяева. Также возможно использовать один препарат для оценки подвижности сперматозоидов и подсчета концентрации. Для этого после проведения оценки подвижности в тот же препарат вносится 96% раствор этилового спирта, путем поднесения смоченной фильтровальной бумаги к краю покровного стекла камеры.

Иногда используют жидкость Рубенкова, которая состоит из основного фуксина – 0,1 г, красителя Романовского – 0,02 мл, концентрированной карболовой кислоты – 0,2 мл, глицерина – 0,1 мл, этилового спирта ректификата – 2 мл, 1% раствора натрия хлорида – 100 мл. Эта жидкость кроме фиксации окрашивает сперматозоиды, что дает возможность оценить морфологию сперматозоидов – сперматограмму.

Камеру готовят для микроскопии, так же, как было описано ранее. Для более удобного исследования рекомендуется выдержать камеру Горяева во влажной среде специального устройства. Это необходимо для оседания клеточных элементов.

Исследование проводится путем микроскопии световым микроскопом (или фазово-контрастным) при увеличении 200х (объектив 20х и окуляр 10х). Подсчет сперматозоидов происходит внутри квадратов камеры Горяева. Если клетка расположена на границе между квадратами, то пользуются правилом подсчета только на одной стороне камеры (правой или левой). Подсчет проводится сперматозоидов, имеющих головку и жгутик. Если встречаются аномальные сперматозоиды, например, без жгутика, то они в подсчет не входят.

Техника подсчета следующая:

· если в одном большом квадрате камеры имеется более 40 сперматозоидов, то подсчету подлежат сперматозоиды, находящиеся в пяти больших квадратах;

· если количество клеток составляет от 10 до 40, то исследуются десять больших квадратов, и если имеется менее чем 10 сперматозоидов, то подсчитываются сперматозоиды, лежащие в 25 квадратах.

Принцип подсчета основан на том, что зная все размеры камеры, соответственно ее объем, можно определить концентрацию клеток, находящихся в данном объеме.

Итак, вначале определяется количество малых квадратов, которые расположены в пяти больших. Это число равно 80 (16 * 5 = 80). Далее определяется объем малого квадрата, который составляет 1/4000 кубических миллиметра (V = 0, 05 мм * 0,05 мм * 0,1 мм = 1/4000 кубических миллиметра). После чего подсчитывается количество сперматозоидов в одном малом квадрате. Это число делят на число малых квадратов (N/80). Определяется число сперматозоидов в 1 кубическом миллиметре. Это выполняется так:

· в 1 кубическом миллиметре объема камеры содержится в 4000 раз больше сперматозоидов, чем в одном малом квадрате.

Формула подсчета числа клеток в 1 кубическом миллиметре следующая:

C = N * 4000/80 = N * 50 (сперматозоидов / кубический миллиметр). Поскольку 1 мл содержит 1000 кубических миллиметра, соответственно количество сперматозоидов в 1 мл определяется по формуле:

C (1 мл) = (N * 50) * 103 (сперматозоидов / мл).

В конце учитывается степень разведения эякулята:

C (общее) = N * 50000 * степень разведения яээкулята.

При проведении подсчетов сперматозоидов в десяти или двадцати пяти больших квадратах следует помнить, что количество малых квадратов будет равно 16 * 10 или 16 * 25. И тогда в формулы подсчета вносятся значения 160 или 400.

Для того чтобы определить концентрацию сперматозоидов во всем эякуляте, необходимо умножить количество клеток в 1 мл эякулята на весь его объем. Для контроля необходимо провести второй подсчет из двух разных порций спермы. Если разница числа сперматозоидов составляет более 5%, то такой результат считают недостоверным и проводят исследование заново.